Первое упоминание о необычном полисахариде с высокой молекулярной массой, который выделили из стекловидного тела бычьего глаза, было сделанo в 1934 году немецкими биохимиками Karl Meyer и John Palmer. Именнo они предложили назвать новое вещество гиалуроновой кислотой. Но еще в 1918 году Levene и Lopez - Suarez выделили из стекловидного тела и пуповинной крови полисахарид, состоявший из глюкозамина, глюкуроновой кислоты и небольшого количества сульфат-иoнов. Тогда его название было мукоитин - серной кислоты, но в настоящее время установилось, что это была гиалуроновая кислота, выделенная с примесью сульфатированных гликозаминогликанов .
В течение следующих 10 лет K. Meyer и ряд других ученых выделили гиалуроновую кислоту из органов животных. В 1937 г F. Kendall выделил гиалуроновую кислоту из капсул стрептококков .
Первый опыт применения ГК в медицине относится к 1943 г., когда советский врач Николай Федорович Гамалея использовал ее в комплексных повязках для обмороженных красноармейцев в военном госпитале. Экстракт из пуповины, названный им «фактором регенерации», был утвержден Минздравом СССР в качестве препарата «Регенератор». Так же венгерский ученый Андре Балаш с 1947 исследовал вязкость ГК в зависимости от pH и ионной силы раствора, ее расщепление под действием ультрафиолета, а также изучал, как гиалуроновая кислота действует на живые клетки .
В настоящее время гиалуронан как объект исследования можно встретить в биохимии, молекулярной биофизике, биоорганической и радиационной химии. Медицинские аспекты включают изучение роли гиалуроновой кислоты в оплодотворении, эмбриогенезе, выработки иммунного ответа, в заживлении ран, онкологических и инфекционных заболеваниях, процессах старения и в решении проблем эстетической медицины. Широкий спектр практического применения гиалурoновой кислоты способствует регенерации эпителия, предотвращает образование грануляционных тканей, спаек, рубцов, снижает отечность, уменьшает кожный зуд, нормализует кровообращение, способствует рубцеванию трофических язв, предохраняет внутренние ткани глаза. Достаточно хорошо гиалурoновая кислота используется в прикладной биохимии и энзимологии в качестве субстрата для количественного определения ферментов гиалуронидазнoго действия .
Что же представляет собой гиалуроновая кислота на самом деле? Это длинная неразветвленная молекула, в которой чередуются остатки D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Не вдаваясь в подробности, отметим, что оба эти вещества - это модифицированные молекулы глюкозы. Молекула гиалурoновой кислоты может содержать более 30 000 остатков каждого из этих веществ. Кроме того, в организме эта цепочка всегда связана с некоторым количеством белка. Интересно, что подобная структура универсальна и встречается у самых разных представителей животного мира и даже у некоторых бактерий. Гиалуроновая кислота относится к классу гликозаминогликанов .
Рисунок 1. Структура гиалуроновой кислоты
Ранее использовались методы получения гиалурoновой кислоты из стекловидного тела глаза коровы и гребешка петуха. Недостатками данных методов производства являлись их дороговизна и наличие примесей белка в конечном продукте, что приводило к большому количеству аллергических реакций на препарат.
Современное производство ГК основано на процессе ферментации с использованием бактерий (Streptococcus equi и Streptococcus zooepidemicus). ГК, полученная таким путем, имеет более высокую степень очистки, чем и объясняется лучшая переносимость ГК пациентами. Биотехнология получения гиалуронана из бактериальных штаммов продуцентов включает культивирование их в подбираемых условиях, при которых на стадии логарифмического роста на поверхности бактериальных клеток формируется капсула из полисахарида, а на стационарной стадии роста ГК может секретироваться в культурaльную жидкость, капсула истончается или полностью исчезает .
ГК чувствительна к кислотно-щелочному гидролизу. Даже слабое подкисление раствора ГК уксусной кислотой приводит к необратимому снижению вязкости в 2,5 раза. Минеральными кислотами ГК полностью гидрoлизуется до глюкурoновой кислоты, глюкoзамина, уксусной кислоты и двуокиси углерода. Разбавленная серная кислота за короткое время гидрoлизует кислоту с образованием кристаллов дисахаридов.
Окислительно-восстановительная деполимеризация гиалурoнана. Деструкция полисахаридной макромолекулы под действием окслительно-восстановительных сред протекает по свободнoрадикальному механизму. Свободные радикалы образуются с участием аскорбиновой кислоты, гиалуронана и кислорода. Доказано, что гиалурoновая кислота депoлимеризуется под действием ионов железа в присутствии аскорбиновой кислоты. Следовательно ГК, выделенная в атмосфере азота или аргона, имеет более высокую степень полимернoсти по сравнению с выделенной на воздухе .
Для медицинского применения необходима стерилизация растворов гиалуронана. Ее осуществляют автоклавированием при температуре 120-130ºС или ионизирующим гамма-излучением. В обоих случаях происходит значительная деполимеризация биополимера и потеря его исходной терапевтической активности. Известны способы защиты растворов гиалуронана от деполимеризации, основанные на добавлении к растворам различных аминокислот, борной кислоты и глицерина, сульфата гидрохинолина, мочевой кислоты, фенольных соединений (пирогаллол) .
Характерные свойства гиалуроновой кислоты – ее выраженная биологическая активность, прекрасная биосовместимость, отсутствие антигенности, раздражающего и других побочных эффектов – обратили на себя внимание ученых. Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам ГК нашла применение в различных областях медицины, косметологии и ветеринарии. Тот факт, что ГК входит в состав многих тканей (кожа, хрящи, стекловидное тело) и является органоспецифичной и видонеспецифичной, обуславливает ее применение в лечении заболеваний, связанных с этими тканями .
Биологические функции гиалуроновой кислоты можно разделить на «пассивные» и «активные». Как инертный материал, ГК участвует в гомеостазе тканей, в стерическом регулировании (осмосе) проникновения каких-либо субстанций, выполняет роль «смазки», улучшающей подвижность суставов и т.д. «Активные» функции ГК заключаются в специфическом связывании с белками в межклеточном матриксе и на поверхности клетки. Такое взаимодействие играет важную роль в образовании хрящевой ткани, в процессах клеточной пролиферации, в морфогенезе и эмбриональном развитии животных, а также в механизмах воспаления и возникновения рака .
Гиалуроновая кислота используется в онкологии как лечебное средство. Механизмы действия ГК на опухолевые клетки разнообразно. На молекулярном уровне механизм заключается в том, что высокомолекулярная ГК, связываясь с рецепторами на клеточной мембране опухолевых клеток, замедляет их миграцию и образование метастазов. Второй механизм действия состоит в том, что введение высокомолекулярной ГК способствует формированию соединительнотканной капсулы вокруг опухоли. Третий механизм связан со свойством высокомолекулярной фракции тормозить васкуляризацию опухоли (прорастание кровеносных сосудов в опухоль) и тем самым приводить к замедлению роста и метастазированию опухолей, а низкомолекулярной, наоборот, индуцировать .
Гиалуроновая кислота довольно хорошо проявила себя в заживлении ожоговых ран, язв, рубцов и послеоперационных вмешательств. Ученые выяснили, что она не имеет раздражающего действия, а даже наоборот вызывает противовоспалительный эффект, способствует быстрой регенерации ткани. Биоэксплантат (пленка) на основе окисленной ГК в эксперименте показал ускоренное заживление швов кишечных анастомозов повышенного риска.
ГК используют при приготовлении фармацевтических композиций в качестве загустителей, смазывающих веществ, агентов для пленочных покрытий, устойчивых к желудочному соку, в частности при получении капсул, гелей, коллоидов и различных устройств (например, контактных линз, предметов из марли и т.д.). Вероятно, в основе механизма накопления в соединительно-тканных структурах ряда лекарственных веществ и антибиотиков лежит связывание их с протеогликанами тканей. То же можно утверждать и о механизмах отложения в тканях, особенно в матриксе соединительной ткани, различных патологических продуктов. В норме в первые сутки заживления ран в них отмечается повышение концентрации ГК, которая связываясь с фибриновой сетью, образует переходный матрикс, стимулирующий активацию и миграцию гранулоцитов, макрофагов и фибробластов, пролиферацию эпителиальных клеток. Кроме того, ГК посредством усиления фагоцитоза способствует более полному очищению раны от некротических элементов. Вследствие усиления активности макрофагов увеличивается образование трофического фактора, который привлекает фибробласты и эндотелиальные клетки в пораженную область .
Содержание гиалуронана в коже человека не постоянная величина. Существуют незначительные сезонные колебания ГК в дерме: летом уровень гиалуронана несколько ниже, чем в зимний период. Это связывают с повышенной скоростью деградации ГК под действием УФ-излучения. Наиболее значимо возрастное уменьшение концентрации ГК. Начиная с 60-летнего возраста происходит кратное снижение концентрации ГК в дерме. Поэтому инъекционное внутриклеточное введение нативной ГК представляется вполне естественным способом воспаления ее дефицита. Данный инъекционный метод в эстетической медицине получил название биоревитализации .
В научной литературе можно встретить обширную информацию о химической структуре, макромолекулярной характеристики, биологических свойствах и медицинском применения гиалуроновой кислоты.
ГК входит в состав основного межклеточного вещества соединительной, эпителиальной и нервной тканей, в большом количестве присутствует в стекловидном теле глаза, синовиальной жидкости суставов, коже, стенках артерий и вен, сердечных клапанах, в глoмерулярной базальной мембране почек.
С момента открытия гиалурoновой кислоты произошла значительная эволюция взглядов. Если вначале считали, что данный полисахарид служит пассивным структурным компонентом межклеточного матрикса, то к настоящему времени он включен во многие биологические процессы: от размножения, миграции, дифференцировки клеток в процессе эмбриогенеза до регуляции процессов воспаления и заживления ран, метастазирования раковых клеток. В организме ГК выполняет множественные физиологические функции: служит основой функционирования системы организма, определяет проницаемость тканей и сосудов кровеносной системы, стойкость к проникновению инфекций . Но с возрастом все функции замедляются.
Такое широкое разнообразие биологических свойств гиaлуроновой кислоты обусловлено функцией молекулярной массы, которая играет значительную роль в поведении клеток, полиморфизмом структурных форм и физико-химическими свойствами молекул разной молекулярной массы, зависящими от ионного окружения и концентрации биополимера в тканях и органах .
Подводя итог, можно сказать, что гиалуроновая кислота нашла свое применение во многих отраслях медицины. Ее применяют в косметологических инъекциях (биоревитализация), входит в состав различных косметических средств. Следует отметить, что ГК может иметь и негативные последствия в частых инъекциях под кожу. Чтобы поддержать свою кожу в тонусе нужно вести здоровый образ жизни, правильно питаться и не злоупотреблять вредными привычками. Так же офтальмологи применяют ее в качестве лечения катаракты, синдрома «сухого глаза». В иммунологии применяют для комплексного лечения иммунодефицитных состояний при вирусных инфекциях. Так же можно использовать для лечения язвенных болезней желудка, двенадцатиперстной кишки, с помощью активации трипсина.
Список литературы
- Егоров Е.А. Гиалуроновая кислота: применение в офтальмнологии и терапии синдрома «сухого глаза» // РМЖ. Клиническая офтальмология. – 2013. – Том 13, №2. С. – 72.
- Сигаева Н.Н., Колесов С.В., Назаров П.В., Вильданова Р.Р. Химическая модификация гиалуроновой кислоты и ее применение в медицине // Вестник Башкирского университета. – 2012. – Т.17. №3. С. – 1221 – 1222.
- Стрельникова Л.Н., Клещенко Е.В., Астрин А.В. Химия и жизнь // Ежемесячный научно – популяционный журнал. – 1.12.2010. №12. С. – 22 – 23.
- Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине. – М.: Практическая медицина, 2012. – 224с.:ил. С. – 9 – 11, 19 – 30, 218.
Сегодня упоминаниями о гиалуроновой кислоте пестрят как глянцевые издания, так и страницы обычных СМИ. Последние несколько лет нам не перестают твердить, что «секрет вечной молодости кожи раскрыт» и предлагают воспользоваться этим «эликсиром». Давайте попробуем разобраться, чего же в этом нездоровом ажиотаже больше – правдивой информации, точного коммерческого расчёта или банальных обывательских заблуждений.
Открытия прошлого, не оправдавшие надежд
Если заглянуть в совсем недавнее прошлое, то можно вспомнить, что аналогичные ситуации уже были в истории медицины:
- Открытие пенициллина преподносилось, как полная победа над микроорганизмами (чего, к огромному сожалению, не произошло, несмотря на теперешний спектр ).
- Выпускаемому инсулину пророчили победу над (препарат для диабетиков жизненно важный и крайне необходимый, но до полной победы над диабетом еще очень далеко).
- Использование первых нейролептиков преподносилось, как возможность излечения от определенных расстройств психики, но и тут все далеко от идеальных ожиданий.
В общем, истинная картина по прошествии некоторого времени всё-таки отличается от прогнозов и первоначальных оценок. Поэтому очень важно относиться ко всему критично и максимально объективно.
Развенчиваем мифы о гиалуроновой кислоте
Никто из медиков не будет спорить, что гиалуроновая кислота важна для организма человека, но то множество информации, которое сегодня можно встретить в СМИ и которое выдаётся за истину, увы, приходит к нам не от профессионалов. Чаще всего новаторские мысли в народ несут различного рода бьюти-эксперты, блоггеры-самоучки и другие люди без профильного – медицинского, фармацевтического или биологического образования. Они высказываются о медицинском препарате на основании собственных оценочных впечатлений, информации из сомнительных источников или информации, вырванной из контекста
Так рождаются заблуждения. Давайте попробуем отделить зерна от плевел и разобраться в этом вопросе более детально.
|
Истина |
|
|
Главное заблуждение в том, что препарат называют в единственном числе, а правильно называть во множественном – кислоты, так как это одно из соединений группы кислых мукополисахаридов, куда входят и другие соединения аналогичного состава и свойств, причем масса их может колебаться в широких пределах. Так как подавляющее большинство препаратов, выходящих под названием «гиалуроновая кислота» производится из биологического сырья без специального разделения фракций, то и считать препарат именно одним, чистым, соединением совсем некорректно. |
|
|
Гиалуроновая кислота – результат открытий бьюти-лабораторий последний двух-трех десятилетий. |
Само вещество было открыто еще в 1930 году и изучением её свойств, функций, а также возможностями применения занялись практически сразу после открытия. Сами исследования не прекращались, а начиная с 70-х годов прошлого века их интенсивность стала нарастать. |
|
Данное вещество используется в косметической и косметологической продукции |
Помимо этого развитого направления гиалуроновая кислота применяется при различных заболеваниях других органов и систем в качестве лекарственного средства. |
|
В косметологических средствах улучшает проникновение полезных веществ внутрь кожи |
Не влияет на уровень клеточной и межклеточной проницаемости для различных веществ |
|
Старение кожи связано с потерей жидкости из-за уменьшения уровня веществ этой группы во всех слоях кожи |
Если снижение содержания гиалуронатов и происходит с возрастом, то не столь значительно, а старение, в том числе и кожи, – сложнейший многогранный общебиологический процесс и сводить его проявления к столь банальным причинам – просто глупо |
Правда о гиалуроновой кислоте
Все свойства и характеристики и отличительные особенности гиалуроновой кислоты подробно описываются в научной и медицинской литературе. Однако она пересыщена множеством терминов, что делает имеющуюся информацию не всегда понятной для простого обывателя.
Если попытаться все несколько упростить – получается что:
Для каждой из фракций присущ свой набор свойств и характеристик. Так низкомолекулярные разновидности вещества обладают прекрасным противовоспалительным действием, что обеспечило их применение при ожогах, трофических язвах, герпетических высыпаниях, псориазе. Среднемолекулярная гиалуроновая кислота способна подавлять размножение клеток и их миграции. Благодаря этим свойствам её задействуют при лечении некоторых артритов и болезней глаз. Высокомолекулярные фракции удерживают вокруг себя огромное количество молекул воды и стимулируют клеточные процессы в самой коже. Эта разновидность гиалуроновой кислоты нашла своё применение в хирургии, офтальмологии и косметологии
Важно знать! Использовать препарат с неуказанной величиной молекул действующего вещества категорически нельзя, так как можно не только не добиться желаемого результата, но и ухудшить состояние.
Основные показания к применению гиалуроновой кислоты
Всегда следует помнить, что введение в организм препаратов гиалуроновой кислоты инъекционно является в первую очередь медицинской манипуляцией. Для использования различных методик и проведения процедур имеются достаточно строгие медицинские критерии.
Так, основными показаниями к применению гиалуроновой кислоты являются:
- появление морщин (снижение тургора кожи) вследствие потери влаги;
- увеличение выраженности имеющихся морщин;
- выраженные мимические морщины;
- необходимость нормализации рельефа кожи;
- необходимость улучшения тургора и контура красной каймы губ.
Препараты гиалуроновой кислоты в эстетической медицине
В современной косметологии восстребованность гиалуроновой кислоты в виде уколов или других форм препарата объясняется:
Современный фармакологический рынок предлагает гиалуроновую кислоту в виде инъекций. При этом она может быть в виде:
- Мезококтейля , включающего в себя основное вещество, дополненное пантенолом, витаминами, коэнзимами, факторами клеточного роста, пептидами и пр. веществами
- Филлеров – дермального наполнителя из сшитой ГК, который со временем биодеградирует – рассасывается в организме. Выпускается в виде геля различной степени вязкости. Чем более вязкое вещество, тем с большими проблемами оно призвано справиться.
- Редермализантов и биоревитализантов . В настоящее время на прилавках аптек можно найти 3 поколения этих препаратов. В основе последних – нуклеиновые кислоты, создающие с ГК комплексы, способные восстанавливать ДНК клеток и ускорять выработку собственной гиалуроновой кислоты, а также эластина и коллагена.
- Биорепарантов – препаратов, содержащих измененную ГК, к цепи которой прикреплены пептиды, витамины, аминокислоты. Они обладают пролонгированным и усиленным действием.
Обратите внимание: в индустрии красоты могут быть задействованы мази, кремы, гели, лосьоны для наружного применения, но их эффективность гораздо ниже эффективности гиалуроновой кислоты для инъекций.
Основные типы процедур для улучшения состояния кожи лица
Наиболее востребованнымиинъекционными процедурами с гиалуроновой кислотой стали:
Основные противопоказания к применению гиалуроновой кислоты
Если маркетологи пытаются вас уверить в том, что уколы гиалуроновой кислоты, куда бы они не осуществлялись, максимально безопасны, знайте: это ложь! На фоне определенных процедур они действительно безопаснее, однако и у этого препарата есть собственные противопоказания.
В числу основных относятся:
- Любые аллергические реакции на действующее вещество или его компоненты.
- Любые инфекционные заболевания в остром периоде.
- Беременность, роды и последующая лактация.
- Патология соединительной ткани.
- Общие и системные заболевания, такие как аутоиммунные поражения, онкологическая патология любых органов и систем, сахарный , патология свертывающей системы крови.
Ко всему, в месте инъекций не должны располагаться , родимые пятна, родинки, шрамы и воспалительные процессы. При несоблюдении этих противопоказаний результаты могут быть плачевными.
Эффективность кремов с гиалуроновой кислотой
Отдельную группу препаратов, причем достаточно распространенных, составляют кремы с гиалуроновой кислотой. Их применяют путем нанесения на поверхность кожи, где они и производят непосредственный эффект.
Для поверхностных изменений, защиты кожи используются средства, содержащие высокомолекулярные фракции, которые создают защитный слой и не проникают внутрь кожи.
Для корректировки глубоких, возрастных изменений лучше подходят средства с низкомолекулярными фракциями действующего вещества, так как оно частично может проникать на определенную глубину во внутренние слои, где и осуществляется их биологическое действие.
Всё большую популярность в последнее время приобретают безинъекционные методики, подразумевающие нанесение геля на кожу с последующим воздействием микротоков, лазера, ультразвука.
Хочется закончить советом: для всего есть свое время и свои причины, а основное правило здоровой жизни, отличного настроения и прекрасной внешности – это умеренность. В погоне за красотой старайтесь использовать даже такое средство, как гиалуроновая кислота, без излишеств, и ваша кожа будет выглядеть хорошо даже в глубокой старости.
Более подробную информацию о применении препаратов гиалуроновой кислоты для лица вы получите, посмотрев видео-обзор:
Совинская Елена Николаевна, терапевт.
Гиалуронан представляет собой гликозаминогликан, который образует во внеклеточном матриксе огромные комплексы с протеогликанами. Особенно в большом количестве эти комплексы присутствуют в хрящевой ткани, где гиалуронан посредством линкерного белка связывается с протеогликаном агреканом
Гиалуронан несет сильный отрицательный заряд и поэтому во внеклеточном пространстве связывается с катионами и с молекулами воды. Это приводит к увеличению жесткости внеклеточного матрикса и создает между клетками водяную подушку, которая гасит силы сжатия
Гиалуронан состоит из повторяющихся единиц дисахаридов, связанных в длинные цепи
В отличие от других гликозаминогликанов, гиалуронановые цепи синтезируются на цитозольной поверхности плазматической мембраны и затем выходят из клетки
Клетки связываются с гиалуронанами с участием семейства рецепторов, известных под названием гиаладгерины, которые инициируют сигнальные процессы, контролирующие миграцию клеток и сборку цитоскелета
Гиалуронан (ГК), также известный под названием гиалуроновая кислота или гиалуронат, представляет собой глюкозаминогликан (ГАГ). В отличие от других гликозаминогликанов (ГАГ), связанных с внеклеточном матриксом, гиалуронан не связан ковалентной связью с протеогликанами сердцевинных белков, а образует очень большие комплексы с секретируемыми протеогликанами.
К числу таких наиболее важных комплексов относятся комплексы, присутствующие в хрящевой ткани, где молекулы ГК , секретируемые хондроцитами (хрящеобразующие клетки), связываются примерно со 100 копиями протеоглика-на агрекана. Агрекановые сердцевинные белки через небольшой линкерный белок связываются с одной молекулой ГК через 40-нм интервалы. Такие комплексы в длину могут достигать более 4 мм и обладать мол массой, превышающей 2 х 108 дальтон. Таким образом, с участием ГК во внеклеточном матриксе хрящевой ткани создаются большие гидратированные пространства.
Эти пространства играют особенно важную роль в тканях с низкой плотностью кровеносных сосудов, поскольку они обеспечивают диффузию питательных компонентов и выведение продуктов обмена из внеклеточного пространства.
Гиалуроновая кислота (ГК) обладают очень простой структурой. Подобно всем ГАГ, они являются линейными полимерами одного из дисахаридов, глюкуроновой кислоты, связанной с N-ацетилглюкозамином посредством (3 (1-3) связи. Как показано на рисунке ниже, молекулы ГК содержат в среднем 10 000 (и до 50 000 этих дисахаридов, связанных b(1-4) связью. Поскольку дисахариды несут отрицательный заряд, они связывают катионы и молекулы воды.
Подобно протеогликанам , ГК увеличивают жесткость внеклеточного матрикса и служат в качестве смазки в таких соединительнотканных структурах, как . Гидратированные молекулы ГК также образуют между клетками водяную подушку, которая позволяет тканям гасить силы сжатия.
CD44 образует гомодимеры или гетеродимеры с рецепторами Erb2.Эти комплексы связываются с рядом сигнальных молекул,
которые контролируют организацию цитоскелета и экспрессию генов.
Молекулы гиалуроновой кислоты (ГК) гораздо крупнее, чем другие ГАГ. Из-за этого клетки должны расходовать на их формирование большие количества энергии. Подсчитано, что для формирования одной среднего размера цепи ГК, необходимо 50 000 эквивалентов АТФ, 20 000 кофакторов НАД и 10 000 групп ацетил-КоА. Поэтому в большинстве клеток синтез ГК находится под жестким контролем.
Синтез гиалуроновой кислоты (ГК) катализируется трансмембранными ферментами, ГК синтазами, локализованными в плазматической мембране. Эти ферменты несколько необычны в том смысле, что они собирают полимер ГК на цитозольной стороне плазматической мембраны, а затем переносят его через мембрану во внеклеточное пространство. Это принципиально отличается от синтеза других ГАГ, которые образуются в аппарате Гольджи и ковалентно связываются с протеогликанами сердцевинных белков по мере их прохождения по секреторному пути.
Важнейшим способом регуляции синтеза гиалуроновой кислоты (ГК) является изменение экспрессии ферментов, ГК синтаз. Экспрессия этих ферментов индуцируется специфичными для клеток факторами роста. Например, фактор роста фибробластов и интерлейкин-1 являются индукторами экспрессии ферментов в фибробластах, в то время как глюкокортикоиды подавляют экспрессию в этих же клетках. Эпидермальный фактор роста стимулирует экспрессию в кератиноцитах, но не в фибробластах. Секреция ГК контролируется независимо от их синтеза, и это обеспечивает, по крайней мере, два способа контроля уровня ГК в тканях.
Наряду с участием в гидратации тканей, гиалуроновая кислота (ГК) связывается со специфическими поверхностными рецепторами, что приводит к стимуляции внутриклеточных сигнальных путей, контролирующих такие процессы, как миграция клеток. Основным рецептором ГК является CD44, относящийся к семейству белков, называемых гиладгеринами, которые связываются с ГК. К остальным представителям этого семейства относятся протеогликаны (например, версикан, агрекан, бревикан) и линкерный белок, который связывает ГК с агреканом в хрящевой ткани. Множественные формы CD44 образуются при альтернативном сплайсинге транскриптов одного гена, хотя функциональные различия между этими изоформами остаются неясными.
CD44 существует в виде гомодимеров, которые экспрессируются во многих типах клеток или в виде гетеродимеров с ErbВ, тирозинкиназой, которая экспрессируется на эпителиальных клетках.
Цитоплазматический участок CD44 обладает несколькими функциями. Он необходим для правильного связывания с ГК и для сортинга рецепторов на клеточной поверхности. Он также участвует в процессах внутриклеточной передачи сигнала. Картирование функциональных областей в цитоплазматическом участке CD44 проводилось при изучении экспрессии мутантных форм CD44 в культуре клеток, и активации сигнальных путей после прикрепления клеток к ГК.
Из этих исследований мы знаем, что гомодимеры CD44 и гетеродимеры CD44/ErbB активируют нерецепторные тирозинкиназы, например Src, а также представителей семейства небольших G-белков, Ras. Эти киназы активируют такие сигнальные белки, как протеинкиназа С, МАР киназа и ядерные факторы транскрипции.
Наряду с этим, как показано на рисунке ниже, сигналы, передающиеся с участием CD44 , могут изменять сборку актинового цитоскелета у поверхности клеток. Это происходит при активации таких белков, связывающих актин, как фодрин и небольшого G-белка, Rac-1. Одним из последствий реорганизации актина является стимуляция миграции клеток под влиянием связывания CD44 с ГК. В опухолях усиление экспрессии CD44 и секреции ГК коррелирует с увеличением ее агрессивности, и является плохим прогностическим признаком.
Обычно считается, что гиалуроновая кислота (ГК ) играет двоякую роль в стимуляции миграции клеток. Во-первых, за счет связывания с внеклеточным матриксом ГК нарушает межклеточные взаимодействия и взаимодействие клеток с матриксом. Мыши, у которых не происходит экспрессии ГК, характеризуются незначительной величиной межклеточного пространства, вследствие чего животные не могут развиваться нормально. Поскольку ГК обладает большим гидратированным объемом, повышенная секреция ГК в опухоли нарушает целостность внеклеточного матрикса, что приводит к образованию больших промежутков, через которые могут мигрировать опухолевые клетки.
Во-вторых, при связывании ГК с рецепторами CD44 могут активироваться внутриклеточные процессы передачи сигналов, непосредственно приводящие к перегруппировкам цитоскелета и к активации миграции клеток. Это подтверждается данными, полученными в экспериментах по добавлению ГК к клеткам в культуре. Клетки, экспрессирующие CD44, начинают мигрировать сразу же после контакта с ГК, и соединения, разрушающие внутриклеточные сигнальные молекулы и связывающиеся с CD44, ингибируют эту миграцию.
Гиалуроновая кислота!О ней много говорят, ее включают в состав рецептур новых средств по уходу за кожей. Все производители косметики утверждают, что используют лучшие типы гиалуроновой кислоты в своих продуктах. Но что такое гиалуроновая кислота, что она делает, как она работает и какой ее тип считается лучшим?
Гиалуроновая кислота (ГК) – самый важный фактор гидратации кожи. Эта молекула образует трехмерную сеть, которая действует как губка и буквально улавливает воду вокруг и внутри своих складок.
Кроме того, ГК используется организмом в качестве смазки в суставах, из нее в основном состоит ушная раковина, она же один из структурных полимеров стекловидного тела глаза. ГК способна стимулировать или ингибировать воспаление, способствует заживлению ран и восстановлению кожного покрова. Она – важная составляющая межклеточного вещества буквально всей соединительной ткани человеческого организма.
В коже ГК находится главным образом в базальной мембране эпидермиса и дерме, поддерживая пространство между клетками, увлажняя и облегчая прохождение питательных веществ.
В организме женщины весом 60 кг содержится около 13 г гиалуроновой кислоты, 4,3 г из этого количества перерабатываются и обновляются каждый день.
Однако прежде чем обсуждать, как работает ГК и что она может сделать для кожи, было бы неплохо сначала представить короткое досье на это вещество для лучшего понимания способа его действия.
Гиалуроновая кислота 101
Гиалуронан, или гиалуроновая кислота, – это натуральный полимер, то есть большая молекула, состоящая из множества повторяющихся маленьких молекул-«субъединиц».
В случае гиалуроновой кислоты этой субъединицей является дисахарид D-глюкуроновая кислота и N-ацетил-D-глюкозамин, связанные вместе.
Длина молекулы ГК может составлять от 2 до 25 тыс. дисахаридов. Молекулярная масса этого природного полимера колеблется от 800 до 2 000 000 Дальтон (Да), при этом средняя молекулярная масса ГК составляет 3 МДа в суставах и около 2 МДа в коже.
Организм непрерывно синтезирует и разрушает ГК (как упоминалось выше, полная замена ГК в организме происходит примерно каждые три дня). По мере постепенной деградации больших молекул ГК образуются фрагменты самой разной молекулярной массы. Набор этих фрагментов – от 800 Да до 2 MДа – присутствует в любой момент времени в нормальных тканях.
По размерам молекулы ГК делятся на разные фракции.
- Очень высокая молекулярная масса: 3–20 MДа.
- Высокая молекулярная масса: ~ 2 MДа.
- Средняя молекулярная масса: ~ 1 MДа.
- Низкая молекулярная масса: ~ 300 кДа.
- Очень низкая молекулярная масса: ~ 60 кДа.
- Олигомеры: от 800 Да до10 кДа.
Внешний вид и биологические эффекты
Очевидно, что молекулы, молекулярная масса которых может различаться в 12 500 раз, выглядят и ведут себя в биологических системах совершенно по-разному, оказывая разные биологические эффекты. Это более подробно показано в многочисленных исследованиях, проведенных в последние годы.
Обычно говорят, что ГК может поглотить воды в 1000 раз больше ее собственного веса. Однако это относится только к высокомолекулярной ГК, а та, что имеет более низкую молекулярную массу, очевидно, способна поглощать гораздо меньше воды.
Поэтому на практике, если взять 1% высокомолекулярной ГК в воде, то можно получить довольно вязкую жидкость или жидкий гель. Низкомолекулярная ГК в той же концентрации будет гораздо менее вязкой жидкостью или совсем водянистым гелем, тогда как олигомер будет таким же жидким, как вода. Излишне говорить, что ГК с молекулярной массой 20 MДа будет в этом случае очень густым гелем.
Вы можете задаться вопросом, зачем столько информации о размерах молекул и внешнем виде геля. Ответ довольно интересен. ГК с молекулярной массой 3–20 MДа, то есть высокомолекулярная ГК, – это тот тип ГК, который обнаруживается при целлюлите. Это аномально большой размер молекул ГА, за счет чего происходит прочное удержание воды в подкожной жировой клетчатке, что в свою очередь способствует проявлению видимых признаков целлюлита.
Поэтому присутствие в тканях ГК со слишком высокой молекулярной массой нежелательно – это признак патологического процесса. С другой стороны, присутствие в тканях слишком большого числа ГК-фрагментов, то есть слишком большого количества олигомеров или даже ГК с молекулярной массой 20 кДа, также нежелательно, поскольку они, как известно, стимулируют воспаление. Однако даже воспаление в некоторых ситуациях имеет право на существование, и иногда это необходимо (например, при заживлении ран).
Все остальные молекулярные массы (50 кДа – 2 МДа) кажутся нейтральными или полезными, причем 2 МДа считается наиболее «нормальной» (если так можно выразиться) и препятствует воспалению.
Таким образом, мы можем утверждать, что единственный действительно «плохой» тип ГК – это ГК с чрезвычайно высокой молекулярной массой, которая также способствует фиброзу.
Диета, образ жизни и гиалуроновая кислота
Предполагается, что диета, богатая овощами (магний) и фруктами (аскорбиновая кислота), помогает повысить естественный синтез ГК в организме. Также некоторые продукты богаты ГК или ее предшественниками. В качестве примера можно привести костный бульон, мясные субпродукты и суставной хрящ.
Гиалуронан можно также принимать внутрь в виде пищевой добавки, и он действительно «достигает» кожи и суставов, помогая увеличить их гидратацию, дольше сохранить молодость и поддержать здоровье. Это похоже на пероральный прием гидролизованного коллагена, что также помогает отсрочить старение кожи, сохранить упругость и эластичность связок и сухожилий.
Ультрафиолетовое излучение уменьшает содержание ГК в коже, что приводит к ее сухости и воспалению. Обеспечив кожу достаточным количеством ГА летом, в том числе «изнутри», мы можем быть уверены, что она сможет оставаться увлажненной и защищенной от солнечных лучей.
Нет никакой специфической пищи, которая обладала бы доказанной способностью увеличивать собственный синтез ГК в организме, но ежедневное употребление определенного количества питьевой воды будет способствовать гидратации, поскольку молекула воды не менее важна для этого, чем гиалуроновая кислота, ведь без воды гиалуронан абсолютно бесполезен. В идеале необходимо выпивать два литра воды в день. Таким образом, для улучшения увлажнения кожи и получения омолаживающего эффекта целесообразно комбинировать оральное применение ГК в виде БАД и употребление достаточного количества воды. Для максимального результата можно дополнительно использовать качественную сыворотку, гель или крем, содержащие ГК.
Кожная абсорбция ГК из косметических рецептур
Поскольку ГК стимулирует репарацию и увлажнение кожи, а кожа производит ее все меньше и меньше по мере старения, само собой разумеется, хочется добавить немного ГК в кожу в виде косметической сыворотки, крема или геля.
Понятно, что ГК с большой молекулярной массой не сможет даже проникнуть в эпидермис, в то время как все, что ниже 300 кДа, проникает в дерму и даже подкожно-жировую клетчатку. Чем ниже молекулярная масса, тем глубже ГК может проникать в кожу.
Однако не все так просто. Как мы уже упоминали выше, нужно понимать, для чего мы используем в своей рецептуре ГК с более низким молекулярным весом. «Проталкивая» ГК с молекулярным весом 20 кДа в кожу, мы вовсе не решаем всех проблем кожи, поскольку для нее это может оказаться как полезным, так и раздражающим воздействием. В случае использования ГК с чрезвычайно низкой молекулярной массой все осложняется еще больше.
Однако в большинстве исследовательских работ показано, что молекулы ГК с молекулярной массой где-то между 50 и 300 кДа хорошо проникают в кожу и оказывают на нее благотворное влияние. Мой личный опыт тоже говорит о том, что это лучший для использования диапазон молекулярных масс.
ГК с молекулярной массой 1 MДа может гидратировать сам эпидермис, не проникая дальше, в то время как молекула с молекулярной массой 2MДа просто сидит на поверхности эпидермиса и больше никуда не идет. С другой стороны, я обнаружил, что ГК с молекулярной массой 10 кДа не так полезна и в высоких концентрациях может раздражать кожу, что подтверждается данными, приведенными в научной литературе.
Столь разная абсорбционная способность ГК, зависящая от ее молекулярной массы, является причиной того, что все больше косметических компаний в настоящее время в рецептурах используют ГК разного молекулярного веса.
Молекулы ГК также могут быть линейными или сшитыми. Линейная молекула – это стандартная ГК, встречающаяся в организме человека и в природе. Сшитая ГК представляет собой изобретение человека, это более стабильная форма ГК с более высокой гидратирующей способностью. Но, к сожалению, сшитая ГК обладает меньшей способностью проникать в кожу, поскольку молекула «более толстая» и не может легко пересечь эпидермис.
Сшитая ГК используется в качестве филлера в мезотерапии, но сегодня ее также можно встретить в составе некоторых антивозрастных кремов.
Сыворотки, гели и кремы
Достаточно легко получить косметическую сыворотку или гель, используя ГК и воду. Однако кремы – это другое дело. Здесь ГК может сильно увеличить нестабильность эмульсионной системы. Поэтому большинство продуктов с ГК на рынке – это гели и сыворотки, которые легче получить.
Многие представленные на рынке косметические средства с ГК содержат около 0,1% этого вещества, то есть 1 часть ГК и 999 частей воды и некоторых других ингредиентов. Однако более концентрированные продукты могут содержать до 2% ГК. Более высокие концентрации нецелесообразны, поскольку крем или гель становятся слишком густыми и неудобными.
Гиалуроновая кислота в настоящее время – один из самых популярных и важных ингредиентов для борьбы со старением кожи и в уходе за лицом. Ее также можно встретить в некоторых средствах для ухода за телом. К сожалению, если тип и концентрация ГК специально не упоминаются на упаковке косметического средства, очень сложно понять, что именно и в каких концентрациях в нем используется, но это относится ко всем ингредиентам косметических рецептур.
С другой стороны, некоторые продукты для ухода за кожей включают в себя активные вещества, которые повышают собственный синтез ГК в коже. Это дает несколько отсроченный результат, но обходит проблему абсорбции ГК, поскольку «собственная» ГК синтезируется внутри кожи. Другие активные вещества, используемые в косметике, могут ингибировать в человеческом организме действие разрушающих ГК ферментов – гиалуронидаз (большинство полифенолов обладает такой активностью). Это продлевает срок полезного использования ГК в коже и подавляет ее раннюю или чрезмерную деградацию.
Каково происхождение ГК для косметики?
Когда-то давно в косметике использовали ГК животного происхождения, получаемую из свиных ушей или петушиных гребней. Я помню, что первая ГК, которую мы купили для использования в наших продуктах в 2002 году, была получена из поросят.
Сегодня ГК производится путем бактериальной ферментации, что позволяет получить стандартный размер молекул – 2 MДa. Затем ее «разрезают» либо ферментами, либо гидролизом и получают молекулы меньшего размера. В организме человека происходит то же самое – ГК с молекулярной массой 2 MДа разрезается на более «мелкие кусочки» ферментами, называемыми гиалуронидазами.
Гиалуронидаза и целлюлит
Иногда, чтобы разрушить ГК с чрезмерно высокой молекулярной массой, о которой мы упоминали выше, врачи вводят в ткани гиалуронидазу.
Одно из таких применений гиалуронидазы – временное сокращение признаков целлюлита. Я использую слово «временное», потому что человеческий организм может восстановить молекулярную массу только что синтезированной ГК до 20 MДа всего за несколько дней.
Таким образом, долгосрочное решение проблемы целлюлита не может быть достигнуто инъекциями гиалуронидазы. Это должны быть меры, в первую очередь направленные на снижение удержания воды в тканях и уменьшение синтеза ГК с молекулярной массой 20 MДa. Но это история для другой статьи…
Заключение
По мере старения в организме человека синтезируется все меньше и меньше ГК, в связи с чем необходимо защитить уже имеющуюся ГК и увеличить ее содержание в коже.
Это можно сделать, избегая чрезмерного воздействия солнца; с помощью диеты, богатой овощами, травами, субпродуктами; выпивая достаточное количество воды; используя хорошие косметические средства для ухода за кожей на основе ГК с молекулами разных молекулярных масс, в идеале – от 50 до 300 кДа.
Биологически активные добавки с гиалуроновой кислотой также помогают, поскольку действительно оказывают благотворное влияние на кожу (и суставы), помогая увлажнять и питать организм «изнутри».
Изобретение относится к птицеперерабатывающей и фармацевтической промышленности, а именно к биохимическому способу получения гиалуроновой кислоты, применяемой в медицине в качестве ранозаживляющего средства и пролонгатора действия различных лекарственных средств, в парфюмерии и косметике. В способе получения гиалуроновой кислоты, включающем измельчение петушиных гребней, экстракцию, объединение экстрактов, отделение водной фазы, осаждение целевого продукта, перед измельчением сырье предварительно обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1: 2, затем измельченное сырье дополнительно подвергают обработке ультразвуком с частотой вибрации 16 - 20 кГц в течение 5 - 10 мин, а экстракцию проводят водой с температурой 45 - 50 o С в течение 20 - 25 мин, при этом отделение водной фазы осуществляют вакуумным фильтрованием, осаждение - 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой препарата. Способ позволяет упростить технологический процесс получения гиалуроновой кислоты. 4 ил., 2 табл.
Изобретение относится к птицеперерабатывающей и фармацевтической промышленности, а именно к рациональному использованию сырьевых ресурсов и развитию нетрадиционных технологий на основе биохимического способа получения гиалуроновой кислоты (ГУК), применяемой в медицине в качестве ранозаживляющего средства и пролонгатора действия различных лекарственных средств, в парфюмерии и косметике. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения гиалуроновой кислоты, предусматривающий многократную экстракцию измельченных куриных гребней водным раствором н-пропилового, изо-пропилового или трет-бутилового спирта, объединение экстрактов, добавление к ним хлорида натрия, расслоение системы, отделение водной фазы и осаждение из него целевого продукта. Степень извлечения гиалуроновой кислоты 50%, содержание белка - менее 1)% . Недостатками способа является длительность процесса экстракции, значительный расход органического растворителя, токсичность производства, ограниченность применения. Технической задачей изобретения является упрощение технологического процесса, сокращение продолжительности экстракции, снижение уровня токсичности, ограниченное использование органического растворителя, полная его регенерация, повышающая экономическую эффективность производства, возможность размещать данное производство на птицеперерабатывающих предприятиях, решая проблему рационального использования сырья. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения гиалуроновой кислоты, включающем измельчение петушиных гребней, экстракцию, объединение экстрактов, отделение водной фазы, осаждение целевого продукта, новым является то, что перед измельчением сырье предварительно обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1:2, затем измельченное сырье дополнительно подвергают обработке ультразвуком с частотой вибрации 16-20 кГц в течение 5-10 мин, а экстракцию проводят водой с температурой 45- 50 o C в течение 20-25 мин, при этом отделение водной фазы осуществляют вакуумным фильтрованием, осаждение - 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3 с последующим фильтрованием и сушкой препарата. Технический результат выражается не только в достижении поставленной задачи, но и в увеличении степени извлечения гиалуроновой кислоты, повышения качества целевого продукта, повышения экологичности производства, разработке и внедрении комплексной технологии, позволяющей использовать остаток животной ткани от выделения кислоты в производстве кормовой муки. Гиалуроновая кислота - типичный мукополисахарид. Важным структурным признаком его является наличие чередующихся остатков аминосахаров и остатков уроновых кислот. В тканях и жидкостях ГУК существует в свободном состоянии или ассоциирована с белками, образуя вязкие растворы. Биополимер входит до 5% к массе в состав основного вещества многих видов соединительной ткани (петушиные гребни, стекловидное тело глаза, синовиальная жидкость, кожа). В тканях петушиного гребня ГУК распределена в мукоидных волокнах подкожного слоя, наиболее широкого у основания . Гиалуроновая кислота - белое, твердое аморфное вещество, растворимое в воде и нерастворимое в органических растворителях. Характерным ее свойством является высокая вязкость. Молекулярная масса составляет от 510 4 - 810 6 , что зависит от происхождения препарата, способа и метода определения . По своей конформации молекулы ГУК представляют собой беспорядочно свернутые клубочки. Применение кислотного гидролиза, метилирования, использование нескольких видов ферментативного гидролиза гиалуронидазами различного происхождения и ряда других методов позволило предложить для гиалуроновой кислоты формулу, в которой чередуются остатки глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Эти дисахаридные фрагменты связаны в молекулы гиалуроновой кислоты - 1,4-связями (фиг.1) . Биологическое значение гиалуроновой кислоты состоит прежде всего в том, что она является цементирующим, как бы склеивающим веществом соединительнотканных систем организма. Она является основой функционирования муколитической системы, определяющей, в частности, проницаемость тканей и сосудов. Вследствие высокого значения молекулярной массы кислота выполняет роль структурообразователя, "связывателя" воды в промежуточных полостях, гелеобразных матрицах, что определяет тургор тканей и повышает их сопротивление действию сжимающих нагрузок. Способствует стойкости организма к проникновению инфекции. Антифрикционные и демпферные свойства тканевых жидкостей, в частности синовиальной, определяются наличием в них биополимера. Биологические свойства кислоты определили широкое ее использование при изготовлении лекарственных, фармацевтических препаратов и косметических изделий. Например, обоснована целесообразность использования ГУК как заменителя стекловидного тела. Использование ее растворов в качестве операционной среды, предохраняющей внутренние ткани глаза от механических воздействий, резко повышает эффективность операций на глазе человека. На основе гиалуроновой кислоты создаются вязкоэластичные материалы. Кроме офтальмологии, кислота используется в ревматологии (для замещения синовиальной жидкости), при лечении артрозов, в артопластике и остеомии для защиты хрящевых поверхностей и периферийного нерва, в дерматологии - для защиты кожных ран при экземах и трофических расстройствах кожи; в производстве косметических препаратов (гели, кремы, лосьоны). При определении общего химического состава коллагенсодержащего сырья пользовались методами: массовой доли влаги -; жира - методом Сокслета ; белка - . Фракционный состав белков определяли последовательным экстрагированием водо-, соле- и щелочерастворимых белковых фракций соответственно дистиллированной водой, раствором хлористого калия с массовой долей 5% и раствором гидроксида натрия с массовой долей 10% с последующим количественным определением белка с биуретовым реактивом . Традиционно в качестве объектов для получения гиалуроновой кислоты используют в основном пупочные канатики, синовиальную жидкость, стекловидное тело глаза, т.к. это сырье является наиболее доступным для специалистов, работающих в области медицины и фармакологии. Петушиные гребни также рекомендуется использовать в качестве источника ГУК . Проведенный нами сравнительный анализ химического состава гребня по отношению к другим коллагенсодержащим продуктам убоя птицы (фиг.2) показал преобладание в нем массовой доли белка (19,8% к массе сырья) при массовом превалировании протеиноидной фракции (14,4% к массе сырья). Проведение специфической гисто-морфологической окраски ткани по методу Ван-Гизона позволило выявить плотно упакованную систему коллагеновых волокон и пучков, определяющих упроченную структуру гребня. Высокая доля коллагеновых волокон в структуре ткани с низкой массовой долей жиров подтверждает целесообразность получения интересующего биополимера. В то же время следует подчеркнуть, что головы птицы с гребнем находят очень ограниченное применение в пищевых целях, а отдельно гребень не используется как исходное сырье совсем. Его выход составляет 3,8% к массе тушки. Таким образом, птицеперерабатывающая промышленность имеет реальные и достаточные резервы в получении биополимера за счет увеличения доли полезного использования вторичных малоценных продуктов переработки. Необходимым условием при производстве гиалуроновой кислоты является, прежде всего, возможность выделения ее в нативном высокополимеризованном состоянии, в виде высокоочищенных препаратов, свободных от белка. Способ получения гиалуроновой кислоты осуществляется следующим образом. Свежие петушиные гребни подвергались предварительной обработке в виде промывки проточной водопроводной водой и обескровливания этиловым спиртом в соотношении 1: 2. Отмытые от крови во избежание окислительной деструкции ткани могут быть "законсервированы" на длительное (до 24 мес.) время при температуре 4-22 o C в 95 %-ном этаноле . Для дальнейшей обработки гребни измельчали на гомогенизаторе (дезинтеграторе, шаровой мельнице) . С целью отделения белка и высвобождения кислоты из ее комплексов с белками и другими мукополисахаридами, подготовленные гребни подвергали ультразвуковой обработке с частотой вибрации 16-20 кГц в течение 5-10 мин и затем водной экстракции при температуре 45-50 o C в течение 20-25 мин. Водный раствор ГУК отделяли от остатка ткани путем вакуумного фильтрования. Из отфильтрованных растворов ГУК осаждали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 и фильтровали. Осадок упаривали над пятиокисью фосфора в вакууме . Далее, в зависимости от назначения ГУК хранят в высушенном виде при температуре не выше -18 o C или растворяют в физиологическом буферном растворе и упаковывают в удобную тару, например в шприцы. Полученный таким способом биопрепарат представляет собой сплетение тончайших нитей большой жесткости. Он легко растворим в воде, давая совершенно прозрачные неопалесцирующие растворы. Промывку проточной водой сырья осуществляли с целью удаления механических примесей с поверхности гребней. Обескровливание проводили этиловым спиртом в соотношении 1:2, что способствует улучшению цвета и степени очистки готового биополимера. Использование более 2 объемов приводит к неоправданным расходам спирта, что экономически нецелесообразно, а менее - не давало желаемого эффекта. Любая процедура выделения ГУК включает последовательное разрушение структур на каждом уровне локализации с целенаправленным использованием при этом определенных факторов. Разрушение структур тканевого уровня достигается измельчением, гомогенизацией для обеспечения, прежде всего, максимального контакта с экстрагентами. Усиливает этот контакт предварительная обработка измельченных тканей гребня птицы ультразвуком, которую проводили с целью не только максимального извлечения биополимера, но и очистки его от белка и других примесей. Отмечено, что рациональной продолжительностью обработки является 5-10 мин. При меньшей продолжительности обработки недостаточен эффект отделения от белка (незначительная степень извлечения). Продолжительность обработки свыше 10 мин приводит к глубокой деструкции коллагеновых волокон и высоким потерям коллагеновой фракции, приводящих также к невозможности полной очистки от белковых примесей, что отражается на снижении качества готового препарата. Изучение влияния частоты вибрации предварительной обработки ультразвуком на эффективность очистки биополимера показывает, что наилучший эффект достигается в интервале 16-20 кГц. Частота менее 16 кГц недостаточна для глубокого и полного разрушения тканей, и, следовательно, снижает выход готового продукта, а выше 20 кГц затрудняет очистку и снижает качество препарата. В процессе водной экстракции значительное влияние на выход гиалуроновой кислоты оказывает температура (фиг.3). Отмечено, что при достижении температуры 50 o C наблюдается максимальный выход биополимера, причем дальнейшее увеличение температуры не приводит к существенным изменениям и создает условия для развития денатурационных и коагуляционных процессов, снижающих чистоту и качество препарата. А температура ниже 50 o C снижает скорость экстракции, и, следовательно, удлиняет весь технологический цикл. Гиалуроновую кислоту извлекают ив водной среды путем осаждения ее 95%-ным этиловым спиртом. Результаты проведенных исследований (фиг.4) показывают, что максимальный выход препарата наблюдается при соотношении водного раствора и спирта 1:3. Дальнейшее добавление объема спирта нецелесообразно, а объемы менее указанных не дают полного осаждения, и, следовательно, выхода продукта. Использование в технологии производства гиалуроновой кислоты спирта подразумевает полную его регенерацию. Согласно оценке химического состава осадок нерастворившихся тканей (массовая доля белка - 14,6%; жира - 5,6%) целесообразно использовать в производстве кормовой муки. Способ получения гиалуроновой кислоты поясняется конкретными примерами. Пример 1. Свежие петушиные гребни подвергают предварительной промывке проточной водопроводной водой и обескровливанию этиловым спиртом в соотношении 1:2. К 100 г измельченных на гомогенизаторе гребней добавляют воду в соотношении 1:3 и помещают в емкость генератора УЗ-колебаний и обрабатывают 5 мин при частоте вибрации 16 кГц. Затем смесь подвергают водной экстракции при температуре 45 o C в течение 20 мин. Экстракт отделяют от гребней вакуумным фильтрованием. Из водной среды гиалуроновую кислоту выделяют путем осаждения 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3. Отфильтрованный осадок упаривают над пятиокисью фосфора в вакууме. Гиалуроновую кислоту хранят в высушенном виде при температуре -18 o C. Данные по примерам 1-4 представлены в табл.1. Как видно из данных табл.1, способ получения гиалуроновой кислоты по режимам, приведенным в примерах 2, 16-20, приводит к получению биопрепарата, уступающего прототипу по качественным показателям, поэтому не является целесообразным с технологической точки зрения. Увеличение расхода спирта на обескровливание сырья и на осаждение кислоты (пример 15, 24) не приводит к снижению качественных показателей по сравнению с прототипом, однако нецелесообразно с экономической точки зрения. Способ получения ГУК по примерам 11-14, 16-23 приводит к недостаточной очистке препарата и снижению выхода. Способ получения гиалуроновой кислоты по режимам в примерах 1, 3-10 позволяет получить биополимер высокой степени очистки и выхода. Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом представлены в табл.2. Степень извлечения гиалуроновой кислоты по предлагаемому техническому решению выше (55%), чем в прототипе. Это обуславливает меньшие затраты в сырьевых источниках. Предлагаемый способ получения гиалуроновой кислоты значительно расширяет область применения технологии из-за нетоксичности производства. Позволяет максимально приблизить его к сырьевому источнику и комплексно перерабатывать сырье. Сокращается продолжительность экстракции. Экономическая эффективность возрастает в результате регенерации использованного спирта. Применение УЗ-обработки повышает выход препарата, что погашает затраты электроэнергии в предлагаемом способе. Полное исключение токсичных растворителей обеспечивает экологичность технологии и позволяет рационально использовать твердый остаток тканей после извлечения ГУК непосредственно на кормовые цели. Источники информации 1. Пат. 2017751 РФ, кл. C 08 B 37/08. Способ получения гиалуроновой кислоты / В.Ю.Ряшенцев, С.Ф.Никольский, Е.С.Вайнерман, В.И.Поляков, А.Н.Гуров, А.Н.Овчинников, Е.Ю.Игнатова /Россия/ - N 4939023/05: Заявлено 22.05.91; Опубл. 15.08.94, Бюл. N 15. 2. Lauert Т.C. // Chemistry and Molekular Biology of the Intercellutar Matrix / Ed. E.A.Balazs. - London, 1970. - P. 730. 3. Степаненко Б. H. Химия и биохимия углеводов /полисахариды/: Учебное пособие для вузов. - M.: Высшая школа, 1977. - 256 с. 4. ГОСТ 9793-74. Мясные продукты. Методы определения влаги. - Взамен ГОСТ 9793-61; Введ. 01.01.75. - M.: Изд-во стандартов, 1978. - 4 с. 5. Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова Л.М. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. - М.: Агропромиздат, 1985. - 296 с. 6. ГОСТ 25011-81. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка. - Введ. 01.01.83. - M.: Изд-во стандартов, 1982. - 10 с. 7. Практикум по биохимии животных / Е.С.Савронь, В.Н.Воронянский, Г.И. Киселев, Чечеткин, Н.Л.Докторович. - М.: Высшая школа, 1967. - 239 с. 8. Рябина B. P., Васюков C.E., Панов В.П., Стародубцев С.Г. Получение, свойства и применение гиалуроновой кислоты // Химико-фармацевтический журнал. - 1987. - N 2, с. 142-153. 9. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с. 10. Игнатова Е.Ю., Гуров А.Н. Принципы извлечения и очистки гиалуроновой кислоты (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1990. - N 3. - С. 42-46.
Формула изобретения
Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий измельчение петушиных гребней, экстракцию, объединение экстрактов, отделение водной фазы, осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что перед измельчением сырье предварительно обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1: 2, затем измельченное сырье дополнительно подвергают обработке ультразвуком с частотой вибрации 16 - 20 кГц в течение 5 - 10 мин, а экстракцию проводят водой при температуре 45 - 50 o C в течение 20 - 25 мин, при этом отделение водной фазы осуществляют вакуумным фильтрованием, осаждение - 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой.
